引言：
近日，中国科学院近代物理研究所胡伟青年研究员团队与清华大学化学工程系张翀教授团队联袂主导的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上发表。
本研究聚焦于凝结芽孢杆菌在促进非食用甜高粱发酵成高产乳酸上的潜力，使用兰州重离子研究装置（HIRFL）构建突变体库，结合全自动高通量微生物液滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）进行高通量、自动化液滴富集、筛选，最终得到具有高渗透压耐受性的凝结芽孢杆菌，与亲本菌株相比，其L-乳酸产量显著提高1倍。此外，该工程菌结合酸水解豆粕和维生素B (VB)化合物在开放式非无菌条件下单批次发酵甜高粱汁，23h发酵可产L-乳酸113.5 g / L，光学纯度高达99.8%，显示出更高效的甜高粱高分子级L-乳酸生物制造潜力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市场需求与生产挑战性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的关键原料，市场需求持续增长。
传统生产依赖粮食基原料（如玉米淀粉），存在与粮食安全冲突、成本高的问题。
非粮原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成为可持续生产的研究方向，但存在发酵效率低、预处理成本高等瓶颈。
2.非灭菌发酵的工业意义
传统发酵需严格灭菌，能耗高且设备复杂，增加生产成本。
开放（非灭菌）发酵可大幅降低能耗和操作难度，但需解决杂菌污染问题，对菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株选择与渗透压耐受性缺陷
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是理想候选菌（耐酸、高温发酵、L-乳酸高产），但其低渗透压耐受性限制了在非灭菌高糖环境中的应用。
甜高粱汁含高浓度糖分（渗透压高），易导致菌体生长抑制，需通过基因工程提升菌株适应性。
4.原料利用的协同策略
甜高粱汁：富含可发酵糖，但碳源单一，需补充氮源。
酸预处理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副产物（如盐离子、酸降解物），进一步增加渗透压压力。
需开发菌株同时耐受高渗透压和抑制物，实现原料高效共利用。
二、菌株筛选与工程菌株验证
1.菌株筛选
（1） 菌株来源与预处理
菌种选择：使用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培养方法参照Yan等（2024）的文献。
菌体收集：将细菌培养至OD₆₂₀ ≈ 0.96，用30%甘油悬浮保存。
（2） 突变库构建
重离子诱变：在兰州重离子研究装置（HIRFL）中，用¹²C⁶⁺离子束辐照处理菌体，诱导基因突变。
初代培养：取100 µL处理后的菌悬液，在42 °C下于MRS固体培养基中培养24小时。
（3） MMC富集
菌体预处理：用富集培养基洗涤菌体（调整OD₆₂₀≈0.13）。
微滴封装：通过MMC（天木生物）生成微升级液滴，将菌体封装至微滴中（2~3 µL / 微滴，共50个微滴）。
富集条件：
①温度：41 °C。
②培养时间：8小时/周期。
③循环操作：每周期将培养好的液滴接种至使用新鲜培养基、新生成的液滴中，共进行40个循环。
（4） 高渗耐受菌株筛选
目标微滴分离：选择OD₆₂₀值高的微滴，转移至无菌EP管。
高盐平板筛选：将菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，筛选形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株验证
（1） 甜高粱汁的预处理
热石灰澄清：用氧化钙（CaO）调节甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒温维持1小时，离心后取上清液。
中和处理：用磷酸调节上清液pH至7.0，继续反应1小时后离心。
酸水解：用98%浓硫酸调节pH至2.0，90℃水解1小时，加入40%氢氧化钙（Ca(OH)₂）悬浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的预处理
酸水解：将160 g干豆粕与800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小时。
中和处理：加入40%氢氧化钙（ Ca(OH)₂ ）悬浮液调节pH至6.8-7.0。
（3） 发酵培养条件
接种准备：使用40-5007菌株作为种子液，接种量为10%（v/v）。
发酵参数：发酵罐体积：5 L（实际装液量2.8 L）。
培养基组成：预处理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培养条件：温度：50 ℃；转速：180 rpm；通气量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一个基于重离子诱变结合微滴富集的高效育种平台，并构建了一株具有高渗透耐受性的L-乳酸高产菌株。使用酸预处理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反应器中转化酸预处理的甜高粱汁，L-乳酸产量为 113.5 g/L、生产率 4.9 g/L/h，并且在非无菌条件下产率为95%。该工程菌株有望以非食用甜高粱为原料实现L-乳酸的高效、低成本生产。
四、研究亮点
1.高渗透压耐受菌株的创制
重离子诱变+高通量微滴筛选：通过重离子束诱变结合自动化微滴微流控技术—MMC，筛选出渗透压耐受性显著提升的凝结芽孢杆菌突变株。与原始菌株相比，突变株在高糖环境下的L-乳酸产量和耐受性均显著提高，为甜高粱汁高效转化奠定基础。
2.营养优化提升转化效率
维生素B补充：通过添加维生素B族，进一步强化菌株代谢活力，提升糖酸转化率。
酸预处理豆粕协同利用：豆粕经酸水解后作为低成本氮源，与甜高粱汁（碳源）复配，提高乳酸产率和生产效率。
3.非灭菌工艺下的高效生产
开放发酵突破：在无需灭菌的条件下，工程菌单批次发酵23小时即产出 113.5 g/L L-乳酸，光学纯度达 99.8% 。
关于MMC
关于我们
天木生物专注于生物育种领域的高端仪器装备的开发与应用，致力于通过高效的突变技术和高通量筛选技术，改造提升产业传统菌种开发模式，为生物制造产业提质增效，提升我国生物产业的核心竞争力。 致力于为行业“细胞和菌种开发与筛选效率低”、“相关装备成本昂贵”、“产业化落地困难”等难题提供优秀的解决方案。
引言：
近日，中国科学院近代物理研究所胡伟青年研究员团队与清华大学化学工程系张翀教授团队联袂主导的研究成果“ Engineering Bacillus coagulans with high osmotic tolerance for enhancing L-lactic acid production using sweet sorghum juice coupled with acid-pretreated soybean meal under unsterile conditions ”在《 Industrial Crops & Products 》期刊上发表。
本研究聚焦于凝结芽孢杆菌在促进非食用甜高粱发酵成高产乳酸上的潜力，使用兰州重离子研究装置（HIRFL）构建突变体库，结合全自动高通量微生物液滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）进行高通量、自动化液滴富集、筛选，最终得到具有高渗透压耐受性的凝结芽孢杆菌，与亲本菌株相比，其L-乳酸产量显著提高1倍。此外，该工程菌结合酸水解豆粕和维生素B (VB)化合物在开放式非无菌条件下单批次发酵甜高粱汁，23h发酵可产L-乳酸113.5 g / L，光学纯度高达99.8%，显示出更高效的甜高粱高分子级L-乳酸生物制造潜力。
一、研究背景
1.L-乳酸的市场需求与生产挑战性
L-乳酸是生物可降解塑料（如聚乳酸）的关键原料，市场需求持续增长。
传统生产依赖粮食基原料（如玉米淀粉），存在与粮食安全冲突、成本高的问题。
非粮原料利用（如甜高粱汁、豆粕）成为可持续生产的研究方向，但存在发酵效率低、预处理成本高等瓶颈。
2.非灭菌发酵的工业意义
传统发酵需严格灭菌，能耗高且设备复杂，增加生产成本。
开放（非灭菌）发酵可大幅降低能耗和操作难度，但需解决杂菌污染问题，对菌株耐受性提出更高要求。
3.菌株选择与渗透压耐受性缺陷
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是理想候选菌（耐酸、高温发酵、L-乳酸高产），但其低渗透压耐受性限制了在非灭菌高糖环境中的应用。
甜高粱汁含高浓度糖分（渗透压高），易导致菌体生长抑制，需通过基因工程提升菌株适应性。
4.原料利用的协同策略
甜高粱汁：富含可发酵糖，但碳源单一，需补充氮源。
酸预处理豆粕：提供低成本氮源，但含抑制性副产物（如盐离子、酸降解物），进一步增加渗透压压力。
需开发菌株同时耐受高渗透压和抑制物，实现原料高效共利用。
二、菌株筛选与工程菌株验证
1.菌株筛选
（1） 菌株来源与预处理
菌种选择：使用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CICC 23843，培养方法参照Yan等（2024）的文献。
菌体收集：将细菌培养至OD₆₂₀ ≈ 0.96，用30%甘油悬浮保存。
（2） 突变库构建
重离子诱变：在兰州重离子研究装置（HIRFL）中，用¹²C⁶⁺离子束辐照处理菌体，诱导基因突变。
初代培养：取100 µL处理后的菌悬液，在42 °C下于MRS固体培养基中培养24小时。
（3） MMC富集
菌体预处理：用富集培养基洗涤菌体（调整OD₆₂₀≈0.13）。
微滴封装：通过MMC（天木生物）生成微升级液滴，将菌体封装至微滴中（2~3 µL / 微滴，共50个微滴）。
富集条件：
①温度：41 °C。
②培养时间：8小时/周期。
③循环操作：每周期将培养好的液滴接种至使用新鲜培养基、新生成的液滴中，共进行40个循环。
（4） 高渗耐受菌株筛选
目标微滴分离：选择OD₆₂₀值高的微滴，转移至无菌EP管。
高盐平板筛选：将菌液涂布于含1 M NaCl的MRS平板，筛选形成大菌落的耐受株。
2.工程菌株验证
（1） 甜高粱汁的预处理
热石灰澄清：用氧化钙（CaO）调节甜高粱汁pH至10.0，60 ℃恒温维持1小时，离心后取上清液。
中和处理：用磷酸调节上清液pH至7.0，继续反应1小时后离心。
酸水解：用98%浓硫酸调节pH至2.0，90℃水解1小时，加入40%氢氧化钙（Ca(OH)₂）悬浮液中和至pH 6.8-7.0。
（2） 豆粕的预处理
酸水解：将160 g干豆粕与800 g 6.25%硫酸溶液混合，90 ℃水解24小时。
中和处理：加入40%氢氧化钙（ Ca(OH)₂ ）悬浮液调节pH至6.8-7.0。
（3） 发酵培养条件
接种准备：使用40-5007菌株作为种子液，接种量为10%（v/v）。
发酵参数：发酵罐体积：5 L（实际装液量2.8 L）。
培养基组成：预处理后的甜高粱汁+豆粕水解液。
培养条件：温度：50 ℃；转速：180 rpm；通气量：0.9 L/min。
三、主要成果
本研究成功建立了一个基于重离子诱变结合微滴富集的高效育种平台，并构建了一株具有高渗透耐受性的L-乳酸高产菌株。使用酸预处理的豆粕和最佳添加的 VB 化合物，工程菌株在 5 L分批生物反应器中转化酸预处理的甜高粱汁，L-乳酸产量为 113.5 g/L、生产率 4.9 g/L/h，并且在非无菌条件下产率为95%。该工程菌株有望以非食用甜高粱为原料实现L-乳酸的高效、低成本生产。
四、研究亮点
1.高渗透压耐受菌株的创制
重离子诱变+高通量微滴筛选：通过重离子束诱变结合自动化微滴微流控技术—MMC，筛选出渗透压耐受性显著提升的凝结芽孢杆菌突变株。与原始菌株相比，突变株在高糖环境下的L-乳酸产量和耐受性均显著提高，为甜高粱汁高效转化奠定基础。
2.营养优化提升转化效率
维生素B补充：通过添加维生素B族，进一步强化菌株代谢活力，提升糖酸转化率。
酸预处理豆粕协同利用：豆粕经酸水解后作为低成本氮源，与甜高粱汁（碳源）复配，提高乳酸产率和生产效率。
3.非灭菌工艺下的高效生产
开放发酵突破：在无需灭菌的条件下，工程菌单批次发酵23小时即产出 113.5 g/L L-乳酸，光学纯度达 99.8% 。
关于MMC
关于我们
天木生物专注于生物育种领域的高端仪器装备的开发与应用，致力于通过高效的突变技术和高通量筛选技术，改造提升产业传统菌种开发模式，为生物制造产业提质增效，提升我国生物产业的核心竞争力。 致力于为行业“细胞和菌种开发与筛选效率低”、“相关装备成本昂贵”、“产业化落地困难”等难题提供优秀的解决方案。
