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天木生物DREM cell成功助力全基因组CRISPRi-微流控筛选,揭示谷氨酸棒杆菌高效分泌蛋白的关联基因

来源:   作者: 发布日期:2023-01-04 访问量:447

本期为您推荐清华大学化工系生物育种技术与装备团队和江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心白仲虎团队发表在代谢工程领域国际知名期刊 Metabolic Engineering 的文章:“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”,论文通讯作者为清华大学张翀和江南大学刘秀霞。文章通过建立全基因组规模CRISPRi文库,结合高通量的分泌蛋白表征技术和液滴微流控筛选平台(DREM cell),在谷氨酸棒杆菌中绘制了蛋白分泌的基因型-表型关联图谱,系统地揭示了其基因组中能够用于改善分泌蛋白生产的基因位点,并最终指导构建了高效分泌重组蛋白的底盘菌株。

图片1

Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen

谷氨酸棒杆菌因其安全(无内毒素)、高细胞密度培养和出色的蛋白质分泌能力,已广泛应用于重组药物蛋白的生产。全基因组规模评价有望指导高产重组蛋白的微生物细胞工厂构建,但由于不仅需要全面的基因型干扰,还需要高通量表型筛选策略,仍存在挑战。

在这项研究中,研究团队构建了谷氨酸棒杆菌基因组规模的CRISPRi文库,并开发了基于双砷-四半胱氨酸反应和皮升级液滴微流控分选平台(DREM cell)的重组蛋白高通量筛选模型,通量可达到>105个单细胞/天。

图片2(1)

Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets

以纳米抗体VHH作为模式分泌蛋白,使用建立的模型对文库中超过50万个单细胞进行高通量筛选,通过多轮筛选富集了大量高产菌株。许多以前未知的基因被确定为在多种细胞过程中发挥作用的有益靶点,包括跨膜转运、氨基酸代谢和氧化还原调节。通过氧还转录因子 CosR RshA 的组合敲除获得了VHH产量提高2.78倍的底盘菌株。

由于 CRISPR 技术和基于双砷-四半胱氨酸反应的液滴微流控筛选平台的普适性,该研究中的“CRISPRi-微流控筛选”平台未来或被广泛应用于各种原核宿主和不同蛋白的分析,助力下一代微生物蛋白细胞工厂的创制。

图片3

Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains

图片4

Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins

论文链接:

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004


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Fig. 1. Schematic overview of the CRISPRi-microfluidics screen

谷氨酸棒杆菌因其安全(无内毒素)、高细胞密度培养和出色的蛋白质分泌能力,已广泛应用于重组药物蛋白的生产。全基因组规模评价有望指导高产重组蛋白的微生物细胞工厂构建,但由于不仅需要全面的基因型干扰,还需要高通量表型筛选策略,仍存在挑战。

在这项研究中,研究团队构建了谷氨酸棒杆菌基因组规模的CRISPRi文库,并开发了基于双砷-四半胱氨酸反应和皮升级液滴微流控分选平台(DREM cell)的重组蛋白高通量筛选模型,通量可达到>105个单细胞/天。

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Fig. 2. Procedure for screening high-producing strains in microfluidic droplets

以纳米抗体VHH作为模式分泌蛋白,使用建立的模型对文库中超过50万个单细胞进行高通量筛选,通过多轮筛选富集了大量高产菌株。许多以前未知的基因被确定为在多种细胞过程中发挥作用的有益靶点,包括跨膜转运、氨基酸代谢和氧化还原调节。通过氧还转录因子 CosR RshA 的组合敲除获得了VHH产量提高2.78倍的底盘菌株。

由于 CRISPR 技术和基于双砷-四半胱氨酸反应的液滴微流控筛选平台的普适性,该研究中的“CRISPRi-微流控筛选”平台未来或被广泛应用于各种原核宿主和不同蛋白的分析,助力下一代微生物蛋白细胞工厂的创制。

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Fig. 3. FlAsH-driven FADS-enriched high-producing strains

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Fig. 4. Genome-wide identification of beneficial gene targets for the production/secretion of r-proteins

论文链接:

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.12.004


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