本期为您推荐天津科技大学路福平教授团队发表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一种多维度组合筛选策略，包括基于生长耦合生物传感器的适应性进化筛选平台（EVOL cell）以及代谢网络重构，实现快速筛选能够高效利用粗甘油生产赤藓糖醇的突变菌株，为生物基产品的开发提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种被广泛研究的宿主菌株，工程化改造后能够将生物柴油行业的副产品粗甘油酯转化为赤藓糖醇，实现其高值化利用，但其生产效率有待提高。因此，需对解脂耶氏酵母的代谢网络进行重构，以实现其工业化应用。
然而，对代谢网络复杂调控细节的了解不足仍然是一个重大挑战。研究者认为需通过多维组合筛选不断挖掘非直观的目标基因，而随机诱变和适应性实验室进化是提高宿主菌株代谢性能的有效方法，因此研究者构建了一套包括生长偶联的适应性实验室进化和代谢网络重构在内的多维组合筛选策略。
本研究利用基于Eryd转录调控因子和其DNA结合序列的生物传感器，构建了响应赤藓糖醇的荧光偶联生物传感器，实现了解脂耶氏酵母中赤藓糖醇水平的动态检测。
图1 赤藓糖醇生物传感器的构建和优化
随后将 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以细胞生长表型作为输出信号，构建了生长偶联的生物传感器。利用ARTP诱变育种仪对含有生长偶联生物传感器的解脂耶氏酵母进行诱变，并通过可实时监测菌株生长条件的EVOL cell自动连续培养筛选突变体，完成全自动适应性进化。
EVOL cell是基于高气体透过性微管路及单相微流控技术开发而成的微生物驯化装备，具有环境氧分压调控、温度控制、化学因子梯度添加等多种适应性进化策略，可满足不同实验需求，灵活调整压力条件，全自动进行单因素或多因素实验。
突变株在EVOL cell中进行了长达48天的连续监测和自动连续培养，全程无需人工值守。经过5个适应阶段的富集（筛选介质中亮氨酸浓度从100 mM逐渐降低到0 mM），最终筛选出了14个具有大型菌落的突变菌株G02-15。在250 mL摇瓶发酵中评估这些突变菌株的赤藓糖醇生产性能，结果显示，G12菌株赤藓糖醇滴度最高（62.4 g/L），是对照菌株G01的4.4倍。
随后对G12进行基因组测序及反向工程，发现SMF1、NADPH脱氢酶和ER1 D46A（M1）突变对赤藓糖醇合成有积极影响。
图2 开发基于生长偶联生物传感器和 EVOL cell筛选平台
随后进一步对赤藓糖醇生物合成的代谢网络进行重构。先对关键酶进行分子修饰，通过迭代组合突变法，提高赤藓糖醇还原酶 ER1 的催化活性。随后敲除分解赤藓糖醇的基因，过表达与甘油同化及前体供应相关的基因，进行代谢网络重构。最终得到的菌株G31赤藓糖醇滴度显著提升了83.5 g/L。
图3 ER基因的分子改造
图4 工程菌株赤藓糖醇生产性能的评价
最后于5L生物反应器中，G31菌株的细胞密度和废弃甘油消耗、赤藓糖醇滴度、生产率和产率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤藓糖醇滴度达到了220.5 g/L，生产率为1.8 g/L/h，产率为0.6 g/g废弃甘油。
本研究为基于生物传感器的解脂耶氏酵母超高通量筛选策略提供了有价值的指导。也展现出了天木生物ARTP+EVOL cell在适应性进化及非直观目标基因挖掘方向的强大潜能。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
本期为您推荐天津科技大学路福平教授团队发表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一种多维度组合筛选策略，包括基于生长耦合生物传感器的适应性进化筛选平台（EVOL cell）以及代谢网络重构，实现快速筛选能够高效利用粗甘油生产赤藓糖醇的突变菌株，为生物基产品的开发提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种被广泛研究的宿主菌株，工程化改造后能够将生物柴油行业的副产品粗甘油酯转化为赤藓糖醇，实现其高值化利用，但其生产效率有待提高。因此，需对解脂耶氏酵母的代谢网络进行重构，以实现其工业化应用。
然而，对代谢网络复杂调控细节的了解不足仍然是一个重大挑战。研究者认为需通过多维组合筛选不断挖掘非直观的目标基因，而随机诱变和适应性实验室进化是提高宿主菌株代谢性能的有效方法，因此研究者构建了一套包括生长偶联的适应性实验室进化和代谢网络重构在内的多维组合筛选策略。
本研究利用基于Eryd转录调控因子和其DNA结合序列的生物传感器，构建了响应赤藓糖醇的荧光偶联生物传感器，实现了解脂耶氏酵母中赤藓糖醇水平的动态检测。
图1 赤藓糖醇生物传感器的构建和优化
随后将 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以细胞生长表型作为输出信号，构建了生长偶联的生物传感器。利用ARTP诱变育种仪对含有生长偶联生物传感器的解脂耶氏酵母进行诱变，并通过可实时监测菌株生长条件的EVOL cell自动连续培养筛选突变体，完成全自动适应性进化。
EVOL cell是基于高气体透过性微管路及单相微流控技术开发而成的微生物驯化装备，具有环境氧分压调控、温度控制、化学因子梯度添加等多种适应性进化策略，可满足不同实验需求，灵活调整压力条件，全自动进行单因素或多因素实验。
突变株在EVOL cell中进行了长达48天的连续监测和自动连续培养，全程无需人工值守。经过5个适应阶段的富集（筛选介质中亮氨酸浓度从100 mM逐渐降低到0 mM），最终筛选出了14个具有大型菌落的突变菌株G02-15。在250 mL摇瓶发酵中评估这些突变菌株的赤藓糖醇生产性能，结果显示，G12菌株赤藓糖醇滴度最高（62.4 g/L），是对照菌株G01的4.4倍。
随后对G12进行基因组测序及反向工程，发现SMF1、NADPH脱氢酶和ER1 D46A（M1）突变对赤藓糖醇合成有积极影响。
图2 开发基于生长偶联生物传感器和 EVOL cell筛选平台
随后进一步对赤藓糖醇生物合成的代谢网络进行重构。先对关键酶进行分子修饰，通过迭代组合突变法，提高赤藓糖醇还原酶 ER1 的催化活性。随后敲除分解赤藓糖醇的基因，过表达与甘油同化及前体供应相关的基因，进行代谢网络重构。最终得到的菌株G31赤藓糖醇滴度显著提升了83.5 g/L。
图3 ER基因的分子改造
图4 工程菌株赤藓糖醇生产性能的评价
最后于5L生物反应器中，G31菌株的细胞密度和废弃甘油消耗、赤藓糖醇滴度、生产率和产率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤藓糖醇滴度达到了220.5 g/L，生产率为1.8 g/L/h，产率为0.6 g/g废弃甘油。
本研究为基于生物传感器的解脂耶氏酵母超高通量筛选策略提供了有价值的指导。也展现出了天木生物ARTP+EVOL cell在适应性进化及非直观目标基因挖掘方向的强大潜能。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
