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天木生物MISS cell在土壤微生物分离中的应用

来源:   作者: 发布日期:2024-03-14 访问量:991

前言


      微生物个体微小、构造简单、进化地位低、分布区域广,在不同的生存环境进化形成了各具特色的生态系统。土壤微生物的群落结构特征的相关分析对从土壤微生态方面降低作物种植成本、提高品质具有重要实践意义。同时复杂的生存环境为土壤微生物带来了丰富的生物多样性和独特的生化机制以及代谢途径,使其在新型生物活性物质的生产方面拥有着巨大的潜力。

      但从复杂的土壤微生物菌群中筛选出合适的菌株始终是一个工作量比较大的任务。传统方法筛选菌种的一般步骤为:菌种采集富集培养纯种分离性能测定菌种保藏,该方法步骤繁琐、耗时较久,需要投入巨大的工作量和重复劳动。因此为了增加筛选效率,科研人员不断的去构建新型的筛选理论和自动化设备,诸多方法也已经成功的被应用在了土壤微生物的筛选领域,如变性梯度凝胶电泳法、实时荧光定量 PCR和微阵列

      天木生物高通量微升级液滴培养组学系统(single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics)是基于液滴微流控技术开发的微型化高通量单细胞培养及分选装备,可以实现对环境菌群在单细胞水平上进行分离培养,液滴生成后存储于高透气性管路中进行孵育,最后通过光学信号(OD、荧光、化学发光等)进行检测分选,分选后的液滴进入多孔板中,用于后续实验。


实验过程

      本案例使用天木生物高通量微升级液滴培养组学系统作为基础构建了土壤微生物的高效筛选模型。

      本次实验样本为野外土壤,称取2g样品,加入5倍体积的生理盐水和玻璃珠,4℃过夜震荡。静置沉降后取上清,用血球板计数,根据上清中菌含量稀释成3个浓度梯度(样品ABC),上机生成液滴,室温培养。同时按照MISS cell上样浓度的5倍分别制成样品DEF,涂平板,室温培养并统计菌落数。

      液滴盘培养15-45天,从60882个液滴分选出带菌液滴5628个,同时涂布平板共88个,统计菌落数共761个。测序结果显示:原始土壤中共检测出1264种菌,液滴体系中共检测出86种菌,平板体系共检测出73种菌(图2)。其中液滴中鉴定出50多种未能在平板中获得的菌株,包括布鲁氏菌、缺陷短波单胞菌等7大类的菌只在液滴中富集。同时由于液滴是单细胞包裹后培养,收集液滴中超过95%是可以进行鉴定后保藏。


结论

      本案例以OD阈值作为筛选依据,对土壤中的多种微生物进行了有效分离,并成功检测出了86株不同的微生物,比传统方法筛选种类高了17.8%,同时大大降低人工成本。该方法证明了微流控筛选系统在土壤微生物分离中的有效性。

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图1 土壤微生物筛选实验流程


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图2 原始土样、液滴和平板富集的细菌测序结果


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图3 原始土样、液滴和平板富集的细菌种类差异






前言


      微生物个体微小、构造简单、进化地位低、分布区域广,在不同的生存环境进化形成了各具特色的生态系统。土壤微生物的群落结构特征的相关分析对从土壤微生态方面降低作物种植成本、提高品质具有重要实践意义。同时复杂的生存环境为土壤微生物带来了丰富的生物多样性和独特的生化机制以及代谢途径,使其在新型生物活性物质的生产方面拥有着巨大的潜力。

      但从复杂的土壤微生物菌群中筛选出合适的菌株始终是一个工作量比较大的任务。传统方法筛选菌种的一般步骤为:菌种采集富集培养纯种分离性能测定菌种保藏,该方法步骤繁琐、耗时较久,需要投入巨大的工作量和重复劳动。因此为了增加筛选效率,科研人员不断的去构建新型的筛选理论和自动化设备,诸多方法也已经成功的被应用在了土壤微生物的筛选领域,如变性梯度凝胶电泳法、实时荧光定量 PCR和微阵列

      天木生物高通量微升级液滴培养组学系统(single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics)是基于液滴微流控技术开发的微型化高通量单细胞培养及分选装备,可以实现对环境菌群在单细胞水平上进行分离培养,液滴生成后存储于高透气性管路中进行孵育,最后通过光学信号(OD、荧光、化学发光等)进行检测分选,分选后的液滴进入多孔板中,用于后续实验。


实验过程

      本案例使用天木生物高通量微升级液滴培养组学系统作为基础构建了土壤微生物的高效筛选模型。

      本次实验样本为野外土壤,称取2g样品,加入5倍体积的生理盐水和玻璃珠,4℃过夜震荡。静置沉降后取上清,用血球板计数,根据上清中菌含量稀释成3个浓度梯度(样品ABC),上机生成液滴,室温培养。同时按照MISS cell上样浓度的5倍分别制成样品DEF,涂平板,室温培养并统计菌落数。

      液滴盘培养15-45天,从60882个液滴分选出带菌液滴5628个,同时涂布平板共88个,统计菌落数共761个。测序结果显示:原始土壤中共检测出1264种菌,液滴体系中共检测出86种菌,平板体系共检测出73种菌(图2)。其中液滴中鉴定出50多种未能在平板中获得的菌株,包括布鲁氏菌、缺陷短波单胞菌等7大类的菌只在液滴中富集。同时由于液滴是单细胞包裹后培养,收集液滴中超过95%是可以进行鉴定后保藏。


结论

      本案例以OD阈值作为筛选依据,对土壤中的多种微生物进行了有效分离,并成功检测出了86株不同的微生物,比传统方法筛选种类高了17.8%,同时大大降低人工成本。该方法证明了微流控筛选系统在土壤微生物分离中的有效性。

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图1 土壤微生物筛选实验流程


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图2 原始土样、液滴和平板富集的细菌测序结果


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图3 原始土样、液滴和平板富集的细菌种类差异






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