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ARTP诱变选育TreY-TreZ途径高产海藻糖菌株及酶促反应条件优化

作者:admin 发布时间:2018/03/01 浏览量:333

自然界中的海藻糖多是由两个葡萄糖残基经α-11糖苷键构成的非还原性二糖,广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、昆虫等生物体内。海藻糖不但能够作为一些生物体的能源物质,它还是一种重要的应激代谢产物。研究表明海藻糖无论在生物体内还是体外均可以保护生物细胞及活性大分子,使其免受高温、干旱、冷冻、高渗等环境下的破坏。因此,海藻糖在分子生物学、医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用前景。


 现已研究发现,海藻糖在生物体内有多种合成途径,其中麦芽寡糖基海藻糖途径(TreY-TreZ途径)以廉价的淀粉为原料,利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyl trehalose synthaseMTSaseTreY基因编码)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose  hydrolaseMTHaseTreZ基因编码)的协同作用,将一定链长的直链淀粉转化为海藻糖。该途径具有特异性较高,快速温和等优点,是工业化生产海藻糖的重要方法之一。目前国内酶法生产海藻糖的转化率较低,成本较高,限制了海藻糖的广泛应用,因此获得高MTSaseMTHase酶活力的菌株是酶法生产海藻糖的关键。ARTP诱变是近几年发展起来的新型诱变技术,它具有对操作者安全、环境友好、操作简便、突变快速、突变率高、获得的突变体性状稳定等特点,目前已经应用到各类微生物育种过程中。


 本研究以实验室保藏的节杆菌属菌株Arthrobacter sp. SH为出发菌株,经常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasmaARTP)诱变选育后,筛选到一株以淀粉为原料TreY-TreZ 途径生产海藻糖的高产突变菌株 Arthrobacter sp. SH-52。该突变菌株酶催化能力达到 129.6U/m L,比出发菌株提高了46.1%。对菌株Arthrobacter sp. SH-52的酶促反应条件进行优化,结果表明,酶促反应最适温度45℃,最适反应时间30h,最适初始pH6.5,最适底物为浓度20%的淀粉液化液(DE值为11.9)。经酶促反应优化后,采用未经纯化的粗酶液进行催化,转化率达到37.6%


  实验结果表明 ARTP 诱变是选育高酶活海藻糖生产菌的有效方法,研究结果对工业化生产海藻糖具有一定的借鉴价值。


1.诱变菌株筛选:

1 菌株的诱变筛选

Table1 The screening result of Arthrobacter sp. SH 


2.诱变菌株 SH-52 粗酶液酶法制备海藻糖的工艺优化

2 海藻糖合成途径的初步验证

Table 2 Preliminary validation of trehalose synthesispathway


2 反应温度对转化率的影响

Fig.2 Effect of reaction temperature on conversionrate


3 反应初始 p H 对转化率的影响

         Fig.3 Effect of initial p H on conversion rate

4 DE值对粗酶液催化反应的影响

        Fig.4 Effect of DE value on conversion rate

5 反应时间与底物浓度对转化率的影响

Fig.5 Effect of reaction time and substrateconcentration on conversion rate

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