近日，江南大学食品科学与技术学院、食品科学与资源国家重点实验室曾茂茂教授团队课题组的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊发表。
该研究通过ARTP诱变获得突变株JNC002.001，纳豆激酶（NK）活性达300.0±4.7 FU/mL，较初始菌株提升1.84倍，为目前报道的食品级安全菌株中最高水平。这项研究表明，ARTP诱变是修饰菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大规模生产和高附加值食品应用。
一、研究背景
纳豆激酶（NK）是一种从纳豆中提取的丝氨酸蛋白酶，具有强效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗动脉粥样硬化功能，是心血管疾病预防的理想天然成分。随着功能性食品和生物医药需求增长，NK全球市场规模持续扩大，但野生菌株产量低（通常<200 FU/mL）限制了工业化应用。
优良菌株筛选方面，传统技术存在以下局限：
①自然筛选：效率低，难以突破产量阈值。
②基因工程：过表达aprN基因可提升产量，但存在质粒丢失、代谢负担及法规限制（食品级安全风险）。
③传统诱变（紫外线、化学诱变）：突变率低，筛选周期长，易引入有害突变。
本次研究采用ARTP诱变具有下列技术优势：
①通过氦气等离子体产生高活性粒子（如自由基、离子），直接破坏DNA链，诱导随机突变，突变率是紫外线的10倍以上。
②属于非转基因，符合食品级安全要求；
③处理时间短（秒级），可通过调整功率和时间精准控制突变强度。
④广谱适用，目前已成功用于细菌、真菌、酵母等多种微生物的高产菌株选育。
二、方法与技术平台
1.菌株筛选与诱变（ARTP）
●初始菌株：从市售纳豆中筛选出高产NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP诱变：将种子培养物离心，并将沉淀重悬于无菌盐水中以达到OD600值为0.6-0.8。将细胞悬液（10 μL）专用金属载片上，使用ARTP-IIS进行诱变。SD2进行60秒ARTP处理（致死率90%）后，通过透明圈法和纤维蛋白活性测定筛选出突变株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP诱变策略在增强枯草芽孢杆菌的NK生产能力方面具有显着的有效性。
2.表型与遗传稳定性验证
●发酵特性：监测突变株的生长曲线、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下图所示，尽管SD2和JNC002.001的OD600从0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生长速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始终高于SD2。JNC002.001在72小时的最大NK活性为300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。发酵36 h后，JNC002.001的NK产量显着高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分别为38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP诱变后表现出孢子形成受损。这对于NK生产可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受损可能将细胞资源从孢子转移到了次级代谢产物的产生，从而增强了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止长时间代谢活性的丧失。
（图 ：枯草芽孢杆菌 SD2 和 JNC002.001 在摇瓶中的发酵过程比较。（A）生长曲线和酶活性。（B）残余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遗传稳定性：连续传代30次后，NK活性保持稳定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多组学分析
SD2的基因组由一条长度为4,120,963 bp的圆形染色体组成，GC含量为43.47%。基因组包含4051个蛋白质编码序列（CDS），87个tRNA基因和30个rRNA基因。
●基因组重测序：识别突变株的SNP和插入突变，定位关键基因（如kinA、gltA）
所有reads均与初始菌株SD2的参考基因组比对。在 7 个蛋白质编码序列中产生8个SNP：包括5错义突变（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3个同义突变（gltA、ganP、mdxK），基因间隔区：2个SNP和1 个插入（Ins），Ins位于mmgA基因的启动子中。
●转录组分析：比较突变株与野生株的基因表达差异，重点关注NK合成、分泌及代谢通路。
转录组测序结果显示，与初始菌株SD2相比，突变株JNC002.001中有2595个DEGs，其中1419个基因显著下调，1176个基因显著上调。
与中心碳代谢相关的关键基因调控图谱及相关通路
说明：基因名称旁边的小方块是指枯草芽孢杆菌JNC002.001与枯草芽孢杆菌SD2基因表达的比较。随着基因表达从下调到上调的变化，小方块的颜色从绿色变为红色。
转录分析中与信号转导相关的aprN调控因子图谱和相关途径
说明：基因名称旁边的小方块是指枯草芽孢杆菌JNC002.001与枯草芽孢杆菌SD2基因表达的比较。随着基因表达从下调到上调的变化，小方块的颜色从绿色变为红色。
三、主要结论
1.高产NK突变株的获得
从纳豆中分离出的野生型枯草芽孢杆菌SD2通过ARTP诱变成功获得了高产NK的枯草芽孢杆菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001显示出可靠的遗传稳定性和显著降低的孢子形成率。
突变株JNC002.001的NK活性较野生型提高1.84倍（300 FU/mL），发酵周期延长至72小时，NK产量持续积累。
2.分子机制解析
●基因组突变：发现10个SNP和1个插入突变，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突变导致孢子形成抑制，资源转向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突变增强α-酮戊二酸代谢，促进谷氨酸积累（NK合成关键前体）。
●转录组变化：aprN基因（编码NK）表达上调9.4倍。中心碳代谢基因（如pfkA、citZ）显著上调，能量和氨基酸前体供应增强。Sec分泌途径（secA、prsA）和蛋白折叠相关基因上调，提升NK分泌效率。
四、研究亮点总结
1.技术方法创新
首次通过ARTP诱变获得食品级安全的高产NK菌株，突破传统诱变效率瓶颈。
结合基因组与转录组分析，系统性揭示NK高产的多层次调控机制。
2.工业应用价值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大规模生产和高附加值食品应用。
孢子形成缺陷减少发酵后期细胞自溶，简化下游纯化工艺。
关于ARTP-ⅡS诱变育种仪
常压室温等离子体诱变育种仪(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技术,开发的世界上首台利用等离子体的手段对微生物、动植物进行诱变育种的专用仪器。
●微生物型ARTP突变率高,结构紧凑、诱变速度快,一次诱变操作(数分钟以内)即可获得大容量突变库,极大地提高了菌种突变的强度和突变库容量。
●全能型ARTP作空间更大,作用强度更高,并针对不同诱变对象如花粉、小颗粒种子、受精卵等的不同特点,进行了结构优化,使操作更简便,应用范围更广,效果更佳,能够满足不同品种的选育需求。
关于天木生物
天木生物专注于生物育种领域的高端仪器装备的开发与应用，致力于通过高效的突变技术和高通量筛选技术，改造提升产业传统菌种开发模式，为生物制造产业提质增效，提升我国生物产业的核心竞争力。
致力于为行业“细胞和菌种开发与筛选效率低”、“相关装备成本昂贵”、“产业化落地困难”等难题提供优秀的解决方案。
近日，江南大学食品科学与技术学院、食品科学与资源国家重点实验室曾茂茂教授团队课题组的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊发表。
该研究通过ARTP诱变获得突变株JNC002.001，纳豆激酶（NK）活性达300.0±4.7 FU/mL，较初始菌株提升1.84倍，为目前报道的食品级安全菌株中最高水平。这项研究表明，ARTP诱变是修饰菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大规模生产和高附加值食品应用。
一、研究背景
纳豆激酶（NK）是一种从纳豆中提取的丝氨酸蛋白酶，具有强效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗动脉粥样硬化功能，是心血管疾病预防的理想天然成分。随着功能性食品和生物医药需求增长，NK全球市场规模持续扩大，但野生菌株产量低（通常<200 FU/mL）限制了工业化应用。
优良菌株筛选方面，传统技术存在以下局限：
①自然筛选：效率低，难以突破产量阈值。
②基因工程：过表达aprN基因可提升产量，但存在质粒丢失、代谢负担及法规限制（食品级安全风险）。
③传统诱变（紫外线、化学诱变）：突变率低，筛选周期长，易引入有害突变。
本次研究采用ARTP诱变具有下列技术优势：
①通过氦气等离子体产生高活性粒子（如自由基、离子），直接破坏DNA链，诱导随机突变，突变率是紫外线的10倍以上。
②属于非转基因，符合食品级安全要求；
③处理时间短（秒级），可通过调整功率和时间精准控制突变强度。
④广谱适用，目前已成功用于细菌、真菌、酵母等多种微生物的高产菌株选育。
二、方法与技术平台
1.菌株筛选与诱变（ARTP）
●初始菌株：从市售纳豆中筛选出高产NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP诱变：将种子培养物离心，并将沉淀重悬于无菌盐水中以达到OD600值为0.6-0.8。将细胞悬液（10 μL）专用金属载片上，使用ARTP-IIS进行诱变。SD2进行60秒ARTP处理（致死率90%）后，通过透明圈法和纤维蛋白活性测定筛选出突变株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP诱变策略在增强枯草芽孢杆菌的NK生产能力方面具有显着的有效性。
2.表型与遗传稳定性验证
●发酵特性：监测突变株的生长曲线、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下图所示，尽管SD2和JNC002.001的OD600从0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生长速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始终高于SD2。JNC002.001在72小时的最大NK活性为300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。发酵36 h后，JNC002.001的NK产量显着高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分别为38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP诱变后表现出孢子形成受损。这对于NK生产可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受损可能将细胞资源从孢子转移到了次级代谢产物的产生，从而增强了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止长时间代谢活性的丧失。
（图 ：枯草芽孢杆菌 SD2 和 JNC002.001 在摇瓶中的发酵过程比较。（A）生长曲线和酶活性。（B）残余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遗传稳定性：连续传代30次后，NK活性保持稳定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多组学分析
SD2的基因组由一条长度为4,120,963 bp的圆形染色体组成，GC含量为43.47%。基因组包含4051个蛋白质编码序列（CDS），87个tRNA基因和30个rRNA基因。
●基因组重测序：识别突变株的SNP和插入突变，定位关键基因（如kinA、gltA）
所有reads均与初始菌株SD2的参考基因组比对。在 7 个蛋白质编码序列中产生8个SNP：包括5错义突变（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3个同义突变（gltA、ganP、mdxK），基因间隔区：2个SNP和1 个插入（Ins），Ins位于mmgA基因的启动子中。
●转录组分析：比较突变株与野生株的基因表达差异，重点关注NK合成、分泌及代谢通路。
转录组测序结果显示，与初始菌株SD2相比，突变株JNC002.001中有2595个DEGs，其中1419个基因显著下调，1176个基因显著上调。
与中心碳代谢相关的关键基因调控图谱及相关通路
说明：基因名称旁边的小方块是指枯草芽孢杆菌JNC002.001与枯草芽孢杆菌SD2基因表达的比较。随着基因表达从下调到上调的变化，小方块的颜色从绿色变为红色。
转录分析中与信号转导相关的aprN调控因子图谱和相关途径
说明：基因名称旁边的小方块是指枯草芽孢杆菌JNC002.001与枯草芽孢杆菌SD2基因表达的比较。随着基因表达从下调到上调的变化，小方块的颜色从绿色变为红色。
三、主要结论
1.高产NK突变株的获得
从纳豆中分离出的野生型枯草芽孢杆菌SD2通过ARTP诱变成功获得了高产NK的枯草芽孢杆菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001显示出可靠的遗传稳定性和显著降低的孢子形成率。
突变株JNC002.001的NK活性较野生型提高1.84倍（300 FU/mL），发酵周期延长至72小时，NK产量持续积累。
2.分子机制解析
●基因组突变：发现10个SNP和1个插入突变，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突变导致孢子形成抑制，资源转向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突变增强α-酮戊二酸代谢，促进谷氨酸积累（NK合成关键前体）。
●转录组变化：aprN基因（编码NK）表达上调9.4倍。中心碳代谢基因（如pfkA、citZ）显著上调，能量和氨基酸前体供应增强。Sec分泌途径（secA、prsA）和蛋白折叠相关基因上调，提升NK分泌效率。
四、研究亮点总结
1.技术方法创新
首次通过ARTP诱变获得食品级安全的高产NK菌株，突破传统诱变效率瓶颈。
结合基因组与转录组分析，系统性揭示NK高产的多层次调控机制。
2.工业应用价值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大规模生产和高附加值食品应用。
孢子形成缺陷减少发酵后期细胞自溶，简化下游纯化工艺。
关于ARTP-ⅡS诱变育种仪
常压室温等离子体诱变育种仪(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技术,开发的世界上首台利用等离子体的手段对微生物、动植物进行诱变育种的专用仪器。
●微生物型ARTP突变率高,结构紧凑、诱变速度快,一次诱变操作(数分钟以内)即可获得大容量突变库,极大地提高了菌种突变的强度和突变库容量。
●全能型ARTP作空间更大,作用强度更高,并针对不同诱变对象如花粉、小颗粒种子、受精卵等的不同特点,进行了结构优化,使操作更简便,应用范围更广,效果更佳,能够满足不同品种的选育需求。
关于天木生物
天木生物专注于生物育种领域的高端仪器装备的开发与应用，致力于通过高效的突变技术和高通量筛选技术，改造提升产业传统菌种开发模式，为生物制造产业提质增效，提升我国生物产业的核心竞争力。
致力于为行业“细胞和菌种开发与筛选效率低”、“相关装备成本昂贵”、“产业化落地困难”等难题提供优秀的解决方案。
