近期，翌圣镁孚泰基于天木生物高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）设备，在《The FEBS Journal》期刊上发表题为Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究论文。该研究使用DREM cell高通量细胞分选仪，结合酶的定向进化技术，对T7 RNAP进行了成功改造，改造后的T7 RNAP在转录过程中能够直接大幅减少dsRNA的生成（仅为野生型的1.8%），同时显著提升了合成mRNA的整体效率和质量。这一突破性进展有望为基因治疗和疫苗开发领域带来革命性的变化，推动相关技术的进一步发展。
研究背景
双链RNA（dsRNA）是体外转录（IVT）过程中常见的副产物，可激活宿主细胞的免疫反应（如通过PKR和OAS通路抑制翻译），影响mRNA药物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端转移酶活性和RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）活性会导致dsRNA生成。传统方法依赖纯化去除dsRNA，但本研究提出通过改造T7 RNAP本身减少dsRNA的产生，以提高mRNA产品的质量和安全性。
方法与技术平台
1、高通量筛选技术（FADS）
原理：基于DREM cell设备液滴微流控方法生成液滴，液滴内包含裂解试剂、荧光底物和过表达目标酶突变体的大肠杆菌细胞，孵育过程进行细胞的裂解和RNA转录，随后将液滴导入分选芯片进行荧光检测和分选。
优势：超高通量（每日筛选106-108液滴）、低试剂消耗（皮升级反应体积）。
流程：构建随机突变库→液滴内转录→荧光检测→分选高荧光液滴（对应低dsRNA突变体）
（液滴生成与分选）
2、分子信标与双探针检测
分子信标：结合RNA 3'端，荧光强度与互补区长度正相关，用于区分完整RNA和dsRNA。
双探针系统：5'端Cy5探针检测RNA产量，3'端FAM探针检测dsRNA含量，通过荧光比值筛选高产低副产物突变体。
3、半理性设计与结构分析
靶点选择：结合分子动力学模拟（GROMACS）和FoldX/PROSS软件，针对T7 RNAP构象转换关键区域（如螺旋C、H亚结构域）进行定点饱和突变。
关键突变位点：A70Q（稳定延伸构象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（减少模板结合偏向性）。
4、功能验证实验
dsRNA检测：J2抗体免疫印迹、ELISA定量。
免疫原性评估：转染RAW264.7细胞检测IFN-β表达，HEK293细胞评估EGFP翻译效率。
酶活性分析：通过发夹结构底物检测RDRP活性，NGS分析RNA 3'端异质性评估末端转移酶活性。
1. 突变体筛选与性能
使用DREM cell生成两个百万级液滴文库（Lib3，Lib5），经过两轮分选成功筛选出关键候选突变体
单点突变体：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）显著降低dsRNA生成（达野生型的3-7%）。
组合突变体：M17（A70Q/F162S/K180E），表现最优，dsRNA含量仅为野生型的1.8%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。
这一结果不仅在体外实验中得到了验证，还在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA可有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗潜力。
2. 机制解析
末端转移酶活性：野生型T7 RNAP倾向于在RNA 3'端添加额外核苷酸（如胞嘧啶），促进互补配对；突变体（如M17）该活性降低50%以上。
RDRP活性：突变体对RNA模板的结合能力减弱，减少了以RNA为模板的互补链合成。
构象稳定性：突变（如A70Q）通过稳定延伸构象，减少流产RNA生成，从而间接抑制dsRNA形成。
为了深入了解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验，揭示了突变体是由于降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而导致dsRNA的降低，这一发现为未来进一步优化 T7 RNAP提供了重要的理论依据。
3. 应用潜力
突变体mRNA的免疫原性显著降低（IFN-β表达下降90%），且翻译效率提高（EGFP阳性细胞数增加）。
为mRNA疫苗/药物的生产提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 随机突变库+DREM cell：构建基于分子信标荧光探针的高通量分选系统，采用DREM cell累计筛选超过107个液滴，筛选效率大幅提升。
2. 微液滴反应体系：液滴内进行细胞裂解、转录反应及荧光探针结合过程，精准捕捉低产dsRNA突变体，试剂消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP组合突变M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 细胞实验验证：M17突变体显著降低免疫因子IFN-β表达，提升EGFP蛋白翻译效率。
5. 机制揭秘：末端转移酶活性是“元凶”，突变体通过降低末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性，减少3'端非模板核苷酸添加，阻断dsRNA互补配对。
关于DREM cell 高通量液滴微流控细胞分选仪
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分选、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自动设备。其结合液滴微流控技术和介电泳分选技术，由多光路荧光检测系统、高速显微成像系统、自动对焦载物台、微全分析系统、介电泳分选系统、图像监控系统和强大的数据处理系统组成。可用于检测、分选、挑取和分离单细胞、细胞团、球体、类器等，为疾病检测、个性化治疗、疫苗研发、单克隆抗体制备以及生物制品制造等领域研究提供了准确、高效、便捷、经济的自动化工具。
近期，翌圣镁孚泰基于天木生物高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）设备，在《The FEBS Journal》期刊上发表题为Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究论文。该研究使用DREM cell高通量细胞分选仪，结合酶的定向进化技术，对T7 RNAP进行了成功改造，改造后的T7 RNAP在转录过程中能够直接大幅减少dsRNA的生成（仅为野生型的1.8%），同时显著提升了合成mRNA的整体效率和质量。这一突破性进展有望为基因治疗和疫苗开发领域带来革命性的变化，推动相关技术的进一步发展。
研究背景
双链RNA（dsRNA）是体外转录（IVT）过程中常见的副产物，可激活宿主细胞的免疫反应（如通过PKR和OAS通路抑制翻译），影响mRNA药物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端转移酶活性和RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）活性会导致dsRNA生成。传统方法依赖纯化去除dsRNA，但本研究提出通过改造T7 RNAP本身减少dsRNA的产生，以提高mRNA产品的质量和安全性。
方法与技术平台
1、高通量筛选技术（FADS）
原理：基于DREM cell设备液滴微流控方法生成液滴，液滴内包含裂解试剂、荧光底物和过表达目标酶突变体的大肠杆菌细胞，孵育过程进行细胞的裂解和RNA转录，随后将液滴导入分选芯片进行荧光检测和分选。
优势：超高通量（每日筛选106-108液滴）、低试剂消耗（皮升级反应体积）。
流程：构建随机突变库→液滴内转录→荧光检测→分选高荧光液滴（对应低dsRNA突变体）
（液滴生成与分选）
2、分子信标与双探针检测
分子信标：结合RNA 3'端，荧光强度与互补区长度正相关，用于区分完整RNA和dsRNA。
双探针系统：5'端Cy5探针检测RNA产量，3'端FAM探针检测dsRNA含量，通过荧光比值筛选高产低副产物突变体。
3、半理性设计与结构分析
靶点选择：结合分子动力学模拟（GROMACS）和FoldX/PROSS软件，针对T7 RNAP构象转换关键区域（如螺旋C、H亚结构域）进行定点饱和突变。
关键突变位点：A70Q（稳定延伸构象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（减少模板结合偏向性）。
4、功能验证实验
dsRNA检测：J2抗体免疫印迹、ELISA定量。
免疫原性评估：转染RAW264.7细胞检测IFN-β表达，HEK293细胞评估EGFP翻译效率。
酶活性分析：通过发夹结构底物检测RDRP活性，NGS分析RNA 3'端异质性评估末端转移酶活性。
1. 突变体筛选与性能
使用DREM cell生成两个百万级液滴文库（Lib3，Lib5），经过两轮分选成功筛选出关键候选突变体
单点突变体：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）显著降低dsRNA生成（达野生型的3-7%）。
组合突变体：M17（A70Q/F162S/K180E），表现最优，dsRNA含量仅为野生型的1.8%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。
这一结果不仅在体外实验中得到了验证，还在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA可有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗潜力。
2. 机制解析
末端转移酶活性：野生型T7 RNAP倾向于在RNA 3'端添加额外核苷酸（如胞嘧啶），促进互补配对；突变体（如M17）该活性降低50%以上。
RDRP活性：突变体对RNA模板的结合能力减弱，减少了以RNA为模板的互补链合成。
构象稳定性：突变（如A70Q）通过稳定延伸构象，减少流产RNA生成，从而间接抑制dsRNA形成。
为了深入了解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验，揭示了突变体是由于降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而导致dsRNA的降低，这一发现为未来进一步优化 T7 RNAP提供了重要的理论依据。
3. 应用潜力
突变体mRNA的免疫原性显著降低（IFN-β表达下降90%），且翻译效率提高（EGFP阳性细胞数增加）。
为mRNA疫苗/药物的生产提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 随机突变库+DREM cell：构建基于分子信标荧光探针的高通量分选系统，采用DREM cell累计筛选超过107个液滴，筛选效率大幅提升。
2. 微液滴反应体系：液滴内进行细胞裂解、转录反应及荧光探针结合过程，精准捕捉低产dsRNA突变体，试剂消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP组合突变M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 细胞实验验证：M17突变体显著降低免疫因子IFN-β表达，提升EGFP蛋白翻译效率。
5. 机制揭秘：末端转移酶活性是“元凶”，突变体通过降低末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性，减少3'端非模板核苷酸添加，阻断dsRNA互补配对。
关于DREM cell 高通量液滴微流控细胞分选仪
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分选、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自动设备。其结合液滴微流控技术和介电泳分选技术，由多光路荧光检测系统、高速显微成像系统、自动对焦载物台、微全分析系统、介电泳分选系统、图像监控系统和强大的数据处理系统组成。可用于检测、分选、挑取和分离单细胞、细胞团、球体、类器等，为疾病检测、个性化治疗、疫苗研发、单克隆抗体制备以及生物制品制造等领域研究提供了准确、高效、便捷、经济的自动化工具。
