前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一种绿藻门小球藻属的普生性单细胞绿藻，也称为绿藻，是地球上最早的生命之一，可以称之为“地球原住民”。蛋白核小球藻体内含有丰富的营养素，包括蛋白质、叶绿素、核酸等，被誉为蛋白质、叶绿素、核酸含量最高的碱性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白质含量可高达50%—70%，远高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白质含量。它还含有8种必需氨基酸，对人体保持健康、增强体质起到积极的作用。此外，蛋白核小球藻还富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡萝卜素，这些物质具有较强的抗氧化能力，可以帮助清除机体新陈代谢产生的自由基，从而起到抗衰老的功效。它还富含多不饱和脂肪酸，如亚油酸和γ-亚麻酸等，具有调节血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不仅作为食品和营养补充剂，还在医药、化妆品、饲料等领域有着广泛的应用。
图1. 蛋白核小球藻
随着全球人口的增长，对食物的需求也在增加，这加剧了在耕地减少和对传统肉类生产的伦理担忧中寻找新蛋白质来源的需求。微藻作为一种有前途的替代蛋白质来源，富含蛋白质、氨基酸、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、维生素和矿物质。然而，在异养培养条件下，由于光合作用依赖的蛋白质合成减少，微藻通常表现出较低的蛋白质含量（<40% 干重），限制了其作为替代蛋白质来源的潜力。为了克服这些挑战，开发具有天然高蛋白质含量的新型微藻菌株对于通过异养发酵高效大规模生产蛋白质至关重要。
本研究利用常压室温等离子体技术（ARTP）对蛋白核小球藻的出发菌株进行突变，产生大规模突变库，然后基于MISS cell装备，诱变后的菌液稀释后上机生成液滴，将细胞（蛋白核小球藻细胞）包裹于液滴中，形成独立的培养单元，细胞包裹在液滴中培养一段时间，通过检测OD600将带菌液滴筛选至多孔板中，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定液滴的蛋白质含量，与出发菌株对比，筛选出高产蛋白质的蛋白核小球藻突变株。
实验过程
图2. 蛋白核小球藻的筛选流程
1. ARTP诱变：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）离心去上清，用无菌去离子水洗涤，重复2-3次；最终用1mL 5%甘油重悬。取10μL上述菌悬液涂布与载片上，设置诱变功率120W，诱变时间为15s，开始诱变。诱变结束将载片上的菌液洗脱至EP管内的生理盐水中。
2. 确定单细胞包裹所需的稀释度：
通过血球计数板计数，用BG11培养基将诱变后菌株浓度稀释至500-1000CFU/mL，原始出发菌株浓度稀释至50-100CFU/mL，工作流程如下：
图3. 样本稀释度确定工作流程
3. MISS cell分离培养：
本实验诱变后菌株和原始出发菌株共生成5000个液滴，培养10天后进行OD600检测及分选，MISS cell仪器工作流程如下图所示。
图4. MISS cell工作流程
4. 蛋白质含量测定-BCA法：
收集到的目标液滴无需扩大培养直接进行蛋白质含量测定。用生理盐水将液滴体积补足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做将蛋白标准品对照，60℃孵育30min后用酶标仪进行测定（吸收波长562nm），与出发菌株对比，确定目标液滴蛋白质产量是否增加及增加量。
实验结果
1. 蛋白核小球藻液滴分选结果
图5. 原始出发菌株培养10天液滴OD
图6. 诱变后菌株培养10天液滴OD值
2. BCA法蛋白浓度测定
根据标准曲线计算原始出发菌株和诱变后菌株筛选的液滴蛋白浓度，其中诱变后有2个菌株蛋白浓度高于原始出发菌株，其中3-A8蛋白浓度与原始出发菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
图7. BSA标准曲线
图8. 原始出发菌株稀释103倍培养10天筛选的液滴蛋白浓度
图9. 诱变菌株稀释200倍培养10天筛选的液滴蛋白浓度
总结
本研究利用ARTP和MISS cell装备，将原始出发菌株诱变后进行单细胞包裹，通过OD600分选和BCA法蛋白浓度测定蛋白质含量，筛选出高产蛋白质的蛋白核小球藻突变株，全程高通量、自动化操作，可以直接对液滴进行蛋白质含量测定，避免二次培养的操作，大幅提高了诱变和单克隆筛选的效率，为高产蛋白质的蛋白小球藻选育提供了一种高效的筛选策略。
前言
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一种绿藻门小球藻属的普生性单细胞绿藻，也称为绿藻，是地球上最早的生命之一，可以称之为“地球原住民”。蛋白核小球藻体内含有丰富的营养素，包括蛋白质、叶绿素、核酸等，被誉为蛋白质、叶绿素、核酸含量最高的碱性植物食品。蛋白核小球藻的蛋白质含量可高达50%—70%，远高于一般食物如牛肉、大豆等的蛋白质含量。它还含有8种必需氨基酸，对人体保持健康、增强体质起到积极的作用。此外，蛋白核小球藻还富含超氧化物歧化酶（SOD）和β-胡萝卜素，这些物质具有较强的抗氧化能力，可以帮助清除机体新陈代谢产生的自由基，从而起到抗衰老的功效。它还富含多不饱和脂肪酸，如亚油酸和γ-亚麻酸等，具有调节血脂、降血黏等功效。蛋白核小球藻不仅作为食品和营养补充剂，还在医药、化妆品、饲料等领域有着广泛的应用。
图1. 蛋白核小球藻
随着全球人口的增长，对食物的需求也在增加，这加剧了在耕地减少和对传统肉类生产的伦理担忧中寻找新蛋白质来源的需求。微藻作为一种有前途的替代蛋白质来源，富含蛋白质、氨基酸、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、维生素和矿物质。然而，在异养培养条件下，由于光合作用依赖的蛋白质合成减少，微藻通常表现出较低的蛋白质含量（<40% 干重），限制了其作为替代蛋白质来源的潜力。为了克服这些挑战，开发具有天然高蛋白质含量的新型微藻菌株对于通过异养发酵高效大规模生产蛋白质至关重要。
本研究利用常压室温等离子体技术（ARTP）对蛋白核小球藻的出发菌株进行突变，产生大规模突变库，然后基于MISS cell装备，诱变后的菌液稀释后上机生成液滴，将细胞（蛋白核小球藻细胞）包裹于液滴中，形成独立的培养单元，细胞包裹在液滴中培养一段时间，通过检测OD600将带菌液滴筛选至多孔板中，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定液滴的蛋白质含量，与出发菌株对比，筛选出高产蛋白质的蛋白核小球藻突变株。
实验过程
图2. 蛋白核小球藻的筛选流程
1. ARTP诱变：
收集蛋白核小球藻菌液（106-107CFU/mL）离心去上清，用无菌去离子水洗涤，重复2-3次；最终用1mL 5%甘油重悬。取10μL上述菌悬液涂布与载片上，设置诱变功率120W，诱变时间为15s，开始诱变。诱变结束将载片上的菌液洗脱至EP管内的生理盐水中。
2. 确定单细胞包裹所需的稀释度：
通过血球计数板计数，用BG11培养基将诱变后菌株浓度稀释至500-1000CFU/mL，原始出发菌株浓度稀释至50-100CFU/mL，工作流程如下：
图3. 样本稀释度确定工作流程
3. MISS cell分离培养：
本实验诱变后菌株和原始出发菌株共生成5000个液滴，培养10天后进行OD600检测及分选，MISS cell仪器工作流程如下图所示。
图4. MISS cell工作流程
4. 蛋白质含量测定-BCA法：
收集到的目标液滴无需扩大培养直接进行蛋白质含量测定。用生理盐水将液滴体积补足20μL，向各孔加入200μL BCA工作液，同步做将蛋白标准品对照，60℃孵育30min后用酶标仪进行测定（吸收波长562nm），与出发菌株对比，确定目标液滴蛋白质产量是否增加及增加量。
实验结果
1. 蛋白核小球藻液滴分选结果
图5. 原始出发菌株培养10天液滴OD
图6. 诱变后菌株培养10天液滴OD值
2. BCA法蛋白浓度测定
根据标准曲线计算原始出发菌株和诱变后菌株筛选的液滴蛋白浓度，其中诱变后有2个菌株蛋白浓度高于原始出发菌株，其中3-A8蛋白浓度与原始出发菌株（最高0.21mg/mL）相比提高了42.86%。
图7. BSA标准曲线
图8. 原始出发菌株稀释103倍培养10天筛选的液滴蛋白浓度
图9. 诱变菌株稀释200倍培养10天筛选的液滴蛋白浓度
总结
本研究利用ARTP和MISS cell装备，将原始出发菌株诱变后进行单细胞包裹，通过OD600分选和BCA法蛋白浓度测定蛋白质含量，筛选出高产蛋白质的蛋白核小球藻突变株，全程高通量、自动化操作，可以直接对液滴进行蛋白质含量测定，避免二次培养的操作，大幅提高了诱变和单克隆筛选的效率，为高产蛋白质的蛋白小球藻选育提供了一种高效的筛选策略。
