Breeding of high-tolerance yeast by adaptiveevolution and high-gravity brewing of mutant

天木生物MMC成功助力高乙醇耐受性酿酒酵母的选育

本期为您推荐河南科技学院杨天佑教授团队发表在Journal of The Science of Food and Agriculture上的一篇文章：Breeding of high-tolerance yeast by adaptive evolution and high-gravity brewing of mutant。本研究采用优化的微生物微滴培养平台(MMC)，对酿酒酵母进行适应性实验室进化(ALE)，筛选得到乙醇耐受性升高的菌株。对获得的优势菌株进行超高浓度酿造工艺研究，表明其在超高浓度啤酒酿造中具有应用价值。

啤酒是世界上消费最广泛的酒精饮料，近年来，越来越多的人喜欢饮用具有多种风格和口味的精酿啤酒。烈性啤酒因为其酒花含量高、风味浓郁、酒精含量高受到如中国，意大利和澳大利亚啤酒喜好者的追捧。烈性啤酒被定义为原始麦芽汁超过16°P(柏拉图度)和酒精含量超过6.5%(v/v)的啤酒。但是超高浓度的酿造会使得酿酒酵母发酵缓慢和活力低下，其中乙醇胁迫源是影响酿造的最主要因素，因此选育高乙醇耐受性菌株成为超高浓度酿造的主要途径。

目前提高酿酒酵母酒精耐受性的主要方法包括适应性实验室进化(ALE)、诱变、原生质体融合，以及基因操作如基因组编辑、代谢工程和靶向基因表达调控等技术。ALE是利用生物体适应所选择的环境条件的能力来改良菌株，而传统的微生物培养方法操作繁琐、产量低、效率低、耗费大量的人力和试剂，导致ALE耗时耗力。而近期基于液滴微流控技术的新型微生物培养和筛选系统，即自动高通量微生物微滴培养系统(MMC)，可以有效的解决上述传统培养所出现的问题，为高效率的筛选乙醇耐受性酵母提供技术基础。

研究团队首先利用前期筛选得到的菌株YN81，在不同浓度的乙醇条件下进行培养，发现12%的乙醇存在时，酵母生长停滞，因此选取6%-12%作为适应性进化浓度范围。在MMC中生成50个液滴体系，在50天的驯化时间内分别6%，6.6%，7.2%， 7.8%， 8.4%，9.0%，9.6% 和12%梯度添加乙醇，传代时间设定为11 h。最后在12%浓度的乙醇条件下，有3株菌可以良好的生长，分别为1，3，45号液滴（图1）。在300、340、380和420 g/L蔗糖的YPD培养基下，筛选菌株的生长速度均高于亲本菌株YN81，其中YN81mc-8.3在420 g/L蔗糖浓度下的细胞浓度明显高于其他菌株，显示出较好的糖耐受性（图2）。同时在不同浓度的乙醇胁迫下YN81mc-8.3也显示出最好的乙醇耐受性（图3）。

对获得的优良菌株在遗传稳定性，超高浓度酿造以及啤酒的口感风味方面进行分析（图4-7）。结果显示筛选出的菌株具有良好的遗传稳定性，在酿造过程中的麦汁速率以及最终的乙醇含量均高于野生型。对酿造出的啤酒进行感官分析表明YN81mc-8.3生产的烈性啤酒在视觉、嗅觉和味觉特征方面有着更好的表现。这些结果显示MMC在高浓度乙醇耐受性的酿酒酵母选育方面具有应用前景。