本期为您推荐天津科技大学生物工程学院路福平教授、秦慧民教授团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于细菌生物传感器，结合高通量液滴分选平台实现了色氨酸羟化酶的定向进化，成功获得了催化活性比亲本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
关于色氨酸羟化酶
5-羟色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一种抑制性神经递质，又名血清素（serotonin），是让我们大脑感到“快乐”的激素，能抑制忧郁、促进褪黑素合成、改善睡眠质量等，对于睡眠与消化都起到至关重要的作用，在治疗疾病等领域有广泛应用。5-HT是色氨酸代谢过程中的中间体，由色氨酸羟化酶（TPH）催化产生。由于TPH天然酶活性不足、稳定性差，限制了工业生产过程，更有效的TPH变体的开发便引起了科学和工业界的极大关注。
定向进化方法与技术平台
基于液滴微流控技术，作者构建了色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP），旨在改善TPH的应用性能。作者设计了一种用于检测L-色氨酸（L-Trp）的细菌生物传感器，该传感器将L-Trp浓度与荧光信号之间联系起来，基于荧光信号检测，结合迭代饱和诱变策略，成功获得了热稳定性提高（45℃条件下的半衰期延长3.2倍），催化活性提高（比亲本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）
1. 色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）的设计与构建
DTPS平台的设计及构建主要分为三个主要步骤（图1）
① 构建TPH突变文库，然后使用液滴生成装置将突变后的产酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含单细胞的液滴，孵育一段时间后，EPB在液滴中进行细胞增殖和L-Trp的生物转化过程；
② 将基因改造后的检测细菌（Detection bacteria，DB）预培养一段时间后，注射入液滴内再次孵育；
③ 通过检测液滴中剩余的L-Trp产生荧光信号来测定酶的工作效率，并分离阳性突变体以进行进一步验证。
图1 色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）构建流程
2. 液滴微流控平台工作流程
DTSP平台由三部分组成：液滴生成、液滴微注入和液滴分选。为了保证液滴的单细胞包裹率，根据泊松分布（μ=0.1）生成包裹单个细胞的液滴，37℃孵育12小时后，根据荧光信号分选获得目标液滴，在培养和分选过程中液滴形态完整，细菌生长状态良好。
控筛选平台（DTSP），旨在改善TPH的应用性能。作者设计了一种用于检测L-色氨酸（L-Trp）的细菌生物传感器，该传感器将L-Trp浓度与荧光信号之间联系起来，基于荧光信号检测，结合迭代饱和诱变策略，成功获得了热稳定性提高（45℃条件下的半衰期延长3.2倍），催化活性提高（比亲本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
图2 液滴微流控平台工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突变文库的筛选
使用epPCR构建CviPAH突变文库，经过两轮活性和热稳定性筛选后，得到了8个优势突变体，酶活性增加了30-113%，且均表现出较好的热稳定性，在45℃下热处理1小时后剩余活性为39.5-53.7%，显著好于野生型CviPAH。结合迭代饱和诱变（ISM）和液滴微流控平台（DTSP）进一步筛选获得突变体M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，热稳定性提高了3.2倍。
图3 基于DTSP的CviPAH突变文库的筛选
总结
细菌生物传感器与基于液滴的微流控筛选平台（DTSP）相结合，在筛选工业用酶等领域具有显著优势。并且，使用两个独立菌株分别进行酶生产和检测，有助于提高筛选过程的准确性和效率。该研究为酶类的筛选提供了一个强有力的工具，并为筛选工业酶建立了一个高效的方案。
天木生物孵化于清华大学无锡应用技术研究院，深耕于液滴微流控领域多年，具有成熟的研发团队，将液滴微流控技术与微管式反应器技术完美结合，其自主研发单细胞高通量分选设备（DREM cell及MISS cell），全自动化完成液滴生成、液滴培养和液滴检测及筛选的全工作流程，广泛应用于医药研发、酶的筛选及进化、合成生物学等多领域。设备自动化程度高，操作简单，大幅提高筛选效率，为医药、工业及科学研发提供强有力的高精尖设备和技术支持。
本期为您推荐天津科技大学生物工程学院路福平教授、秦慧民教授团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于细菌生物传感器，结合高通量液滴分选平台实现了色氨酸羟化酶的定向进化，成功获得了催化活性比亲本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
关于色氨酸羟化酶
5-羟色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一种抑制性神经递质，又名血清素（serotonin），是让我们大脑感到“快乐”的激素，能抑制忧郁、促进褪黑素合成、改善睡眠质量等，对于睡眠与消化都起到至关重要的作用，在治疗疾病等领域有广泛应用。5-HT是色氨酸代谢过程中的中间体，由色氨酸羟化酶（TPH）催化产生。由于TPH天然酶活性不足、稳定性差，限制了工业生产过程，更有效的TPH变体的开发便引起了科学和工业界的极大关注。
定向进化方法与技术平台
基于液滴微流控技术，作者构建了色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP），旨在改善TPH的应用性能。作者设计了一种用于检测L-色氨酸（L-Trp）的细菌生物传感器，该传感器将L-Trp浓度与荧光信号之间联系起来，基于荧光信号检测，结合迭代饱和诱变策略，成功获得了热稳定性提高（45℃条件下的半衰期延长3.2倍），催化活性提高（比亲本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）
1. 色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）的设计与构建
DTPS平台的设计及构建主要分为三个主要步骤（图1）
① 构建TPH突变文库，然后使用液滴生成装置将突变后的产酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含单细胞的液滴，孵育一段时间后，EPB在液滴中进行细胞增殖和L-Trp的生物转化过程；
② 将基因改造后的检测细菌（Detection bacteria，DB）预培养一段时间后，注射入液滴内再次孵育；
③ 通过检测液滴中剩余的L-Trp产生荧光信号来测定酶的工作效率，并分离阳性突变体以进行进一步验证。
图1 色氨酸羟化酶超高通量微流控筛选平台（DTSP）构建流程
2. 液滴微流控平台工作流程
DTSP平台由三部分组成：液滴生成、液滴微注入和液滴分选。为了保证液滴的单细胞包裹率，根据泊松分布（μ=0.1）生成包裹单个细胞的液滴，37℃孵育12小时后，根据荧光信号分选获得目标液滴，在培养和分选过程中液滴形态完整，细菌生长状态良好。
控筛选平台（DTSP），旨在改善TPH的应用性能。作者设计了一种用于检测L-色氨酸（L-Trp）的细菌生物传感器，该传感器将L-Trp浓度与荧光信号之间联系起来，基于荧光信号检测，结合迭代饱和诱变策略，成功获得了热稳定性提高（45℃条件下的半衰期延长3.2倍），催化活性提高（比亲本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突变体。
图2 液滴微流控平台工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突变文库的筛选
使用epPCR构建CviPAH突变文库，经过两轮活性和热稳定性筛选后，得到了8个优势突变体，酶活性增加了30-113%，且均表现出较好的热稳定性，在45℃下热处理1小时后剩余活性为39.5-53.7%，显著好于野生型CviPAH。结合迭代饱和诱变（ISM）和液滴微流控平台（DTSP）进一步筛选获得突变体M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，热稳定性提高了3.2倍。
图3 基于DTSP的CviPAH突变文库的筛选
总结
细菌生物传感器与基于液滴的微流控筛选平台（DTSP）相结合，在筛选工业用酶等领域具有显著优势。并且，使用两个独立菌株分别进行酶生产和检测，有助于提高筛选过程的准确性和效率。该研究为酶类的筛选提供了一个强有力的工具，并为筛选工业酶建立了一个高效的方案。
天木生物孵化于清华大学无锡应用技术研究院，深耕于液滴微流控领域多年，具有成熟的研发团队，将液滴微流控技术与微管式反应器技术完美结合，其自主研发单细胞高通量分选设备（DREM cell及MISS cell），全自动化完成液滴生成、液滴培养和液滴检测及筛选的全工作流程，广泛应用于医药研发、酶的筛选及进化、合成生物学等多领域。设备自动化程度高，操作简单，大幅提高筛选效率，为医药、工业及科学研发提供强有力的高精尖设备和技术支持。
